Daño hepático e inmunidad en cabras vacunadas con catepsina e infectadas con ‘fasciola hepatica’

Redacción oviespana.com28/09/2016

Patricia Moreno Pérez realizó en el pasado curso académico una tesis doctoral en la Universidad de Córdoba titulada ‘Evaluación del daño hepático y respuesta inmunitaria local en cabras vacunadas con catepsina L1 e infectadas con fasciola hepatica’.

El objetivo del presente estudio ha sido estudiar la eficacia protectora, así como las lesiones hepáticas y la respuesta inmunitaria inmunitaria local en cabras nmunizadas con catepsina L1 recombinante (CL1) de ‘F. hepática’ con dos adyuvantes (Montanide Isa 70 VG y Quil A), con el segundo adyuvante se estudiaron las lesiones y respuesta inmunitaria en fases tempranas y tardías de la enfermedad.

Para alcanzar los objetivos propuestos se realizaron dos experiencias, en la ‘experiencia 1’ se utilizaron 21 cabras, hembras, de raza Florida Sevillana de 4 meses de edad que fueron divididas en tres grupos: los grupos 1 y 2 correspondieron al grupo adyuvante (n=8) (Montanide) y grupo inmunizado con CL1 en Montanide (n=8), respectivamente; el grupo 3 (n=5) correspondió al grupo control negativo (no infectado y no inmunizado). Sobre los grupos 1 y 2 se realizaron tres inmunizaciones separadas entre ellas por un periodo de 3 semanas. Posteriormente, en la 10ª semana desde la primera inmunización, los animales fueron infectados con 200 metacercarias viables de ‘F. hepatica’ procedentes de la Universidad de Bristol (Reino Unido), y finalmente sacrificados 15 semanas después de la infección (15 spi) para estudiar el número de parásitos, eliminación de huevos, lesiones hepáticas y respuesta inmunitaria en fases tardías.

En la ‘experiencia 2’ se utilizaron 27 cabras, machos, de raza Malagueña de 4 meses de edad que fueron dividas también en 3 grupos: los grupos 4 y 5 correspondieron al grupo adyuvante (n=10) (Quil A) y grupo inmunizado con CL1 utilizando Quil A como adyuvante (n=10) respectivamente; el grupo 6 (n=7) correspondió al grupo control negativo (no infectado y no inmunizado). En los grupos 4 y 5 se realizaron dos inmunizaciones separadas por 4 semanas y posteriormente se infectaron en la semana 10 con una dosis de 100 metacercarias de ‘F. hepatica’ de origen ovino (Ridgeway Research Ltd., UK). Además, en este ensayo tres animales de cada grupo fueron sacrificados por inyección intravenosa de tiobarbital a los 7, 8 y 9 días después de la infección (dpi) para estudiar los cambios durante las primeras etapas de la misma. Las cabras restantes (7 animales en los grupos 4 y 5; 4 animales en el grupo 6) fueron eutanasiadas 15 semanas después de la infección (15 spi). Las dos experiencias fueron aprobadas por el Comité de Bioética de la Universidad de Córdoba para experimentación animal.

El estudio parasitológico no mostró diferencias significativas entre los grupos vacunados y controles adyuvantes en ambas experiencias, tanto en el número de parásitos recuperados como en la tasa de implantación. El análisis estadístico llevado a cabo respecto a la longitud y anchura de los parásitos adultos tampoco mostró diferencias significativas entre los grupos de ambas experiencias, exceptuando el ancho observado en los animales pertenecientes a la experiencia 1 donde esta medida si fue significativamente menor en el grupo vacunado. Respecto a la ganancia de peso no hubo diferencias entre grupo vacunado y control adyuvante en la experiencia 1, mientras que en la experiencia 2 sí hubo una ganancia de peso significativamente mayor en el grupo vacunado respecto al control de adyuvante.

El estudio anatomopatológico macroscópico en las fases tardías de ambas experiencias mostró lesiones típicas de la infección por ‘F. hepatica’ y coinciden de forma genérica con las observadas por otros autores en ovinos y caprinos. Si bien los animales de ambas experiencias mostraron lesiones similares, éstas fueron más severas en los animales de la experiencia 1 respecto a los de la experiencia 2 como cabría esperar debido a la mayor dosis de infección y mayor número de parásitos recuperados.

Respecto a los nódulos linfáticos hepáticos en ambas experiencias se observó un aumento significativo en el tamaño y el peso de los grupos infectados respecto al control no infectado.

Las lesiones microscópicas hepáticas observadas en las fases tardías de ambas experiencias fueron similares a las descritas por otros autores en infecciones crónicas de ‘F. hepatica’. La comparación entre grupos no mostró diferencias estadísticas significativas, aunque en el grupo CL1 de la experiencia 1 se observó un mayor número de eosinófilos y leucocitos globulares, mientras que el grupo Montanide mostró mayor número de granulomas.

En cuanto a las lesiones microscópicas de los nódulos linfáticos hepáticos (NLH) se observó una marcada hiperplasia de folículos linfoides y cordones medulares principalmente en todos los grupos infectados, sin diferencias entre grupos vacunados y controles de adyuvante, aunque sí que hubo correlación estadística entre el número de fasciolas recuperadas y el aumento de peso de los NLH.

El estudio macroscópico de las lesiones hepáticas observadas en las fases tempranas de la enfermedad (experiencia 2) demostró que el número de focos hemorrágicos y trayectos de necrosis fueron más severos en el grupo vacunado que en grupo Quil A, así como mayor porcentaje de eosinófilos en focos de necrosis del grupo CL1. Estos resultados sugieren que la inmunización con CL1 en Quil A parece retrasar la llegada de las larvas al hígado, si bien los resultados de fases crónicas indican que el parásito es capaz de adaptarse e implantarse de manera similar a la que ocurre en los animales no vacunados.

La respuesta inmunitaria celular local en hígado, estudiada mediante inmunohistoquímica, fue severa en los dos grupos infectados de la experiencia 1 respecto al control no infectado. La expresión de las distintas subpoblaciones fue muy similar en ambos grupos, siendo ligeramente superior en el grupo CL1, en especial el significativo aumento de células CD8+. Respecto a los NLH se observó una severa respuesta celular en ambos grupos infectados respecto al control no infectado, encontrándose en corteza valores superiores de linfocitos CD2+ y CD8+ (tanto en corteza como en médula) en el grupo Montanide respecto al CL1, aunque sin diferencias significativas. Por el contrario, los linfocitos CD4+ fueron significativamente más bajos en el grupo CL1 respecto al Montanide. La expresión de citoquinas (IL-4 e IFN- ɣ ) fue muy escasa en todos los grupos infectados.

El estudio inmunohistoquímico llevado a cabo en hígado en las fases tempranas de la experiencia 2 mostró un infiltrado severo alrededor de los focos de necrosis en comparación con el grupo infectado. No se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos infectados salvo para los linfocitos CD2+ (marcador Pan T) que fueron significativamente más altos en el grupo CL1 respecto al grupo Quil A. En esta experiencia la presencia de células tanto IL-4 como INF- ɣ positivas fue muy ocasional tanto en las lesiones hepáticas como en los NLH. La expresión de iNOS en células peritoneales sí mostró un aumento significativo en el grupo CL1 respecto al grupo Quil A, lo que unido a las menores lesiones hepáticas en fases tempranas del grupo inmunizado sugiere que esta enzima podría jugar un papel importante en la respuesta frente al parásito en fases tempranas de la infección.

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