Serotipado de Mannheimia Haemolytica mediante PCR a Tiempo Real

TERCERA SESIÓN / SANIDAD (1ª). Comunicaciones técnicas.

Arnal J.L.1, Cid D. 2, Sanz C. 1, Fernández-Garayzabal J.F.2,3, Vela A.I.2,3, Fernández A. 1*

1 Exopol SL Diagnóstico y Autovacunas, Zaragoza.

2 Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense, Madrid.

3 Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET), Universidad Complutense, Madrid

INTRODUCCIÓN

La Pasteurelosis de los pequeños rumiantes se caracteriza principalmente por el desarrollo de lesiones neumónicas. Puede cursar de forma sobreaguda produciendo septicemias con muerte súbita o producir neumonías de curso agudo con fiebre, depresión y anorexia, o de curso subclínico/crónico que reducen la capacidad pulmonar. Todo ello deriva en importantes pérdidas económicas por mortalidad, descenso en la ganancia de peso, gastos de tratamiento y decomisos en matadero. Se pueden afectar ovinos y caprinos de cualquier edad, siendo los más susceptibles los corderos y cabritos de corta edad y las reproductoras en torno al periodo de parto (Gilmour y Gilmour, 1989; Goodwin-Ray et al., 2008; Marru et al., 2013).

Se usa el término Pasteurelosis para referirnos a la enfermedad causada por bacterias de la familia Pasteurellaceae, que incluye los géneros Pasteurella, Mannheimia y Bibersteinia (CAST, 2008). Otras denominaciones de la pasteurelosis neumónica ovina son neumonía enzoótica, neumonía crónica no progresiva o síndrome respiratorio ovino (SRO) (Radostits et al., 2000).

Mannheimia haemolytica, Bibersteinia trehalosi y Pasteurella multocida son las tres especies bacterianas, todas ellas incluidas anteriormente en el género Pasteurella, que pueden ser aisladas en estos casos y que originan mayor morbilidad y mortalidad en pequeños rumiantes. M. haemolytica es considerada el principal agente etiológico de este proceso, y se asocia con neumonías que pueden ser de curso muy agudo en animales jóvenes. B. trehalosi se asocia principalmente con infecciones sistémicas agudas en corderos, aunque también se aísla de neumonías (Gilmour y Gilmour, 1989) e incluso se ha descrito algún caso de septicemia en ovejas adultas por este agente (Szeredi et al., 2018). P. multocida se ha considerado tradicionalmente menos importante pero lo cierto es que se sabe poco de la epidemiología de la infección por este agente y hay estudios que confirman su importancia como agente respiratorio (Gilmour y Gilmour, 1989, Quinn et al., 2011).

Tanto M. haemolytica como B. trehalosi han sufrido varias reclasificaciones. Ambas se consideraban pertenecientes al complejo Pasteurella haemolytica, que incluía cepas del biovar A y T. El biovar A se constituyó en un nuevo género, Mannheimia, que actualmente incluye 5 especies (M. haemolytica, M. glucosida, M. granulomatis, M. ruminales y M. varigena). Por otro lado, P. haemolytica biovar T se renombró como Pasteurella trehalosi y posteriormente se reclasificó como un género distinto, pasando a denominarse Bibersteinia trehalosi (Blackall et al., 2007).

Para M. haemolytica se han descrito 12 serotipos capsulares distintos (A1, A2, A5, A6, A7, A8, A9, A12, A13, A14, A16 y A17), mientras que para B. trehalosi se han descrito 4 (T3, T4, T10 y T15). El serotipo A11 se reclasificó como M. glucosida (Angen et al., 1999). Para el serotipado se han usado varios métodos laboratoriales, siendo la hemaglutinación indirecta (IHA) uno de los más utilizados (Biberstein, 1978; Pinto, 2011). Este método además de ser muy laborioso, carece de reactivos (antisueros) disponibles comercialmente y puede dar tanto reacciones cruzadas como ausencia de reacciones en aquellas cepas que tras varios pases pierden la cápsula. Todo ello ha impedido que los laboratorios de diagnóstico realicen el serotipado de forma rutinaria, a pesar de que los pocos trabajos de investigación llevados a cabo en pequeños rumiantes confirman gran variabilidad de serotipos presentes en la cabaña ovina española (González et al., 2013; Fernández et al., 2016), lo que puede tener implicaciones a la hora de establecer medidas de control.

Más recientemente, Klima et al. (2017) han publicado un método multiplex de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de cepas pertenecientes a los serotipos A1, A2 y A6, que son los más frecuentes en ganado bovino, especie económicamente mucho más importante que los pequeños rumiantes a nivel mundial. El objetivo del presente trabajoes desarrollar una serie de ensayos de PCR a tiempo real (qPCR) que permitan la identificación de los serotipos A1, A2 y A6 de M. haemolytica de forma específica y asequible para los laboratorios, de modo que pueda ser implementado en el diagnóstico de rutina en todas las especies rumiantes, con la ventaja de ser aplicable tanto sobre cepas aisladas como directamente sobre muestras clínicas sin necesidad de obtener las cepas en cultivo. Paralelamente se determinará la frecuencia de los distintos serotipos en una colección de aislados recientes de M. haemolytica obtenidos en España a partir de muestras clínicas de ganado ovino, caprino y bovino.

MATERIAL Y MÉTODOS

■ Cepas de referencia y aislados de campo

Se utilizaron 12 cepas de referencia procedentes de diversas colecciones de cultivos tipo pertenecientes a cada uno de los serotipos de M. haemolytica para la validación de los ensayos qPCR diseñados (Tabla1). Posteriormente se seleccionaron un total de 159 aislamientos de campo de M. haemolytica (Tabla 2), 59 de ellos obtenidos de ganado bovino, 37 de ganado caprino y 63 de ovino. Excepto 24 aislamientos de ovino procedentes de la colección de la Universidad Complutense de Madrid (UCM) que fueron obtenidos de pulmones de matadero que presentaban lesiones neumónicas, el resto (135) fueron aislados de muestras de animales enfermos de diferentes casos clínicos no relacionados, llegados al laboratorio Exopol (Zaragoza) para diagnóstico, procedentes de toda la geografía española, entre 2016 y 2018. Estos aislamientos se obtuvieron a partir de pulmones y lavados broncoalveolares de rumiantes enfermos, mediante siembra en agar sangre Columbia (Oxoid) e incubación a 37ºC durante 24 horas. Una vez obtenidos los aislamientos se identificaron por espectrometría de masas Maldi Tof (matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight) (Bruker) y por qPCR para la que se utilizó un ensayo comercial (Exoone Mannheimia haemolytica. Exopol, España).

Los 159 aislamientos fueron clonados a partir de una única colonia que se propagó en cultivo (agar sangre Columbia a 37ºC 24h) y en cada uno de ellos se procedió al serotipado por hemaglutinación indirecta (IHA) en la UCM y por qPCR en Exopol. Los métodos se llevaron a cabo de forma independiente en cada uno de los centros y a ciegas.

■ Hemaglutinación indirecta

La serotipificación por IHA ser realizó siguiendo la técnica descrita por Biberstein (1978) con modificaciones (Pinto, 2011). Los antisueros para cada uno de los serotipos (A1, A2, A5-A9, A12-A14, A16, A17) se produjeron en conejos inoculándolos con cepas de referencia. Para la IHA se utilizaron eritrocitos de carnero fijados con una solución de glutaraldehído que se sensibilizaron con los extractos térmicos (60ºC; 30 minutos) de las cepas de campo. Con los hematíes sensibilizados se realizó la prueba de IHA enfrentándolos a cada uno de los antisueros, e incubándolos a temperatura ambiente. La presencia de hemaglutinación indica una reacción positiva.

■ Extracción de ácidos nucleicos y qPCR

La extracción de los ácidos nucleicos de cada una de las cepas se realizó mediante el kit MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit (Thermofisher) en el equipo de extracción automática KingFisher Flex System (Thermofisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ensayos qPCR para la identificación de los serotipos A1, A2 y A6 de M. haemolytica se desarrollaron en base a publicaciones recientes de otros autores que han validado ensayos de PCR convencional (Klima et al., 2017) y que son considerados hoy en día de referencia. Los nuevos ensayos qPCR desarrollados para este estudio pueden trabajar en formato multiplex utilizando los canales FAM, HEX y Cy5 para obtener una información simultánea de las determinaciones.

Para establecer el nivel de concordancia entre las 2 pruebas se calculó el coeficiente Kappa de Cohen con un nivel de confianza del 95%.

Para los serotipos distintos a A1, A2 y A6, se consideró un resultado concordante entre IHA y qPCR cuando mediante IHA una cepa fue identificada como perteneciente a otro serotipo distinto o fue considerada no tipable y mediante qPCR fue negativa para A1, A2 y A6.

Aquellas cepas con resultado no concordante por ambos métodos se analizaron por PCR convencional siguiendo el procedimiento descrito por Klima et al. (2017).

■ Resultados y Discusión

Los resultados de qPCR para las 12 cepas de referencia se muestran en la Tabla 1. Las cepas de referencia de los serotipos A1, A2 y A6 fueron correctamente clasificadas. Las cepas de referencia de los restantes serotipos dieron resultados negativos a excepción de la cepa del serotipo A17 que fue clasificada como serotipo A2 (Tabla 1). Esta reacción cruzada no fue detectada por Klima et al. (2017) ya que en su trabajo no incluyeron ninguna cepa del serotipo A17, que ha sido descrito en una sola ocasión en ganado ovino de Siria (Younan y Fodor, 1995) y por tanto se le presupone muy poco frecuente. De hecho, ninguno de los aislados de campo de este estudio se ha identificado como serotipo A17 mediante IHA. No obstante, esa posible reacción cruzada es un hecho a tener en cuenta que deberá solventarse rediseñando los ensayos a medida que se investiguen nuevas secuencias genéticas.

En cuanto a los 159 aislamientos de campo, la serotipificación fue coincidente por ambos métodos en el 93,1% de los casos (n=148), encontrando discrepancias únicamente en 11 aislamientos (Tabla 3). La concordancia entre ambos métodos fue muy buena con un índice de correlación (Kappa) superior a 0.9 para cada uno de los serotipos A1, A2 y A6 (Tabla 4).

En los 11 aislamientos con resultados discrepantes se aplicó la PCR multiplex convencional descrita por Klima et al., (2017) para los serotipos A1, A2 y A6 como técnica de referencia, que confirmó todos los resultados de qPCR. De esos 11, 6 se habían clasificado como no tipables mediante IHA, mientras por qPCR dos se tipificaron como serotipo A1 y cuatro como serotipo A2, probablemente debido a la mayor sensibilidad analítica de las técnicas de PCR. Una posible explicación para ello es la menor capacidad inmunógena de algunas de las cepas de referencia utilizadas para la obtención de los antisueros en conejos, como ya se ha descrito para algunas cepas de los serotipos A2, A6, A8 y A9 (Martin-Espada et al., 2011).

Por otra parte, de los restantes 5 aislamientos con resultados no concordantes, uno de ellos fue serotipo A2 según qPCR pero serotipo A12 según IHA, mientras que los otros 4 fueron negativos a serotipos A1, A2 y A6 por qPCR pero identificados como A2 oA6 por IHA. Para explicar estas discrepancias habría que realizar un estudio molecular de esos aislados, ya que podrían justificarse por la existencia de posibles variaciones genéticas en las secuencias diana que impidan su amplificación con los cebadores diseñados Sin embargo, tampoco puede descartarse la posible existencia de reacciones inespecíficas de los sueros policlonales.

Dando como válidos todos los resultados obtenidos por qPCR con los 3 ensayos desarrollados en este estudio para los serotipos A1, A2 y A6, se han logrado tipificar 112 de los 159 aislados de campo (70.4 %). De los 47 restantes, 19 fueron clasificados en 7 serotipos distintos a A1, A2 y A6 por IHA y 28 (17,61%) fueron considerados no tipables.

En el Gráfico 1 quedan reflejados los resultados por especies. En bovino, el 84,7% de las cepas se caracterizan como serotipo A1, A2 ó A6, quedando un 12% como no tipables. El único serotipo distinto, detectado por IHA, ha sido el A16 con 2 cepas (3.4%). El más frecuente de todos ellos en esta especie ha sido el serotipo A1, con el 54.2% del total de bovino.

En ganado caprino el 78,4% de los aislados se han podido tipar mediante estas 3 qPCR, siendo notable la ausencia de serotipo A1. El 16,2% quedan como no tipables y el único serotipo distinto detectado aunque también de forma muy minoritaria (5.4%) ha sido el A9.

En ovino sin embargo se observa mucha más variabilidad de serotipos presentes. Los serotipos A1, A2 y A6 suman solamente un 52,4% del total, encontrado casi igual porcentaje de serotipos A1 y A2 y algo menos de serotipo A6. Hay un alto porcentaje de aislados no tipables (23,8%) y el 23.8% restante se clasifican en 5 serotipos distintos, siendo el A8 y el A9 los más frecuentes. No se han observado diferencias significativas entre los aislamientos obtenidos en matadero de lesiones pulmonares, que a priori consideraríamos más crónicas, y los obtenidos de muestras clínicas de animales enfermos.

Los resultados para las especies bovina y ovina coinciden con lo publicado en otros estudios. En bovino casi el 90% de aislados pertenece a alguno de los 3 serotipos estudiados. Según otros autores, los serotipos A1 y A6 están más asociados a enfermedad clínica que el serotipo A2 que se detecta habitualmente en mucosa nasal de animales sanos (Saadati et al., 1997; Klima et al., 2017). Sin embargo en este estudio todos los aislamientos se obtuvieron de animales con clínica y del tracto respiratorio inferior (pulmón o lavado bronquioalveolar).

La ausencia de estudios en cabras no nos permite comparar los resultados de este estudio con datos previos si bien cabe destacar las diferencias encontradas con el ganado ovino. Mientras en caprino el serotipo A2 es muy mayoritario, en ovino hay gran diversidad de serotipos y se distribuyen de forma más homogénea encontrando además un alto porcentaje de cepas no tipables, datos que son similares a los descritos en otros estudios llevados a cabo en nuestro país (González et al., 2013; Fernández et al., 2016). Ninguno de los aislados de este estudio se ha confirmado por PCR como serotipo A12, mientras que González et al. (2013) encontraban un 25% por IHA.

Estos resultados demuestran que con los 3 ensayos qPCR desarrollados es posible caracterizar la gran mayoría de aislamientos de M. haemolytica en rumiantes. No es posible afirmar que todas las cepas de serotipos A1, A2 y A6 vayan a ser detectadas por esta técnica pero se ha demostrado que pueden identificar aislados de esos serotipos que dan reacción negativa mediante IHA, reduciendo el porcentaje de cepas NT. Otra ventaja de la qPCR es que podría aplicarse directamente en muestras tales como pulmón o lavado broncoalveolar. Los ensayos para los serotipos A1, A2 y A6 pueden trabajar en formato multiplex utilizando los canales FAM, HEX y Cy5 para obtener una información simultánea de las determinaciones, permitiendo detectar infecciones múltiples en las distintas muestras clínicas sobre las que puede aplicarse y dando un valor con capacidad cuantificadora. Todo ello, añadido a la mayor sensibilidad respecto al cultivo que de forma general presenta esta técnica, hace que sea idónea para ser implementada en el diagnóstico rutinario.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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