La seroprevalencia a Maedi Visna se correlaciona directamente con el tiempo de estabulación

Iratxe Leginagoikoa de la Arena presentó ante la Universidad de León una tesis doctoral titulada ‘Epidemiología y diagnóstico de la infección por el virus Maedi Visna en diferentes sistemas de explotación ovinos españoles’. En esta tesis doctoral se presenta una investigación sobre la epidemiología y el diagnóstico de la infección por el virus Maedi Visna en ovino, concretamente sobre la transmisión de VMV en distintos sistemas de producción y sobre el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el VMV libre e integrado en células, en diversas matrices sanguíneas. Las hipótesis epidemiológicas de partida son consecuencia de resultados de estudios experimentales y epidemiológicos previos de nuestro grupo de trabajo que indican la mayor importancia de la transmisión horizontal del VMV frente a la vía lactógena en el mantenimiento de la infección en rebaños ovinos. Los resultados de esta tesis confirman dicha conclusión y mejoran el conocimiento de la transmisión del virus en rebaños ovinos. Por otro lado, las aportaciones relativas al diagnóstico también suponen un avance en la búsqueda de una metodología que maximice el éxito de detectar el virus y facilite el estudio de la infección.

El primer trabajo presenta los resultados de un estudio de transmisión horizontal del VMV en un grupo de 191 ovinos de raza Latxa sometidos a una presión de infección horizontal alta o baja. El grupo, formado por corderos de 1 año de edad con una seroprevalencia inicial de VMV de 15% aproximadamente, se dividió en dos lotes. El lote de alta presión de infección (grupo H) incluyó a las hembras que se incorporaron como reposición a un rebaño de ovejas latxas adultas en producción lechera cuya seroprevalencia de VMV fue 42966%. El lote de baja presión de infección (grupo L) lo integraron corderos machos que se mantuvieron aislados de otros ovinos en una nave bien ventilada. Durante los tres años que duró el estudio se sangraron los animales cada 6 meses y se analizaron anticuerpos mediante ELISA (enzyme9linked immunosorbent assay) y secuencias de ADN de virus integrado en monocitos con una PCR de las secuencias repetitivas largas terminales (LTR9 PCR). Al final del experimento la seroprevalencia no varió en el grupo L y fue 57% en el grupo H. La concordancia de los resultados de ambas técnicas medida con el coeficiente kappa, osciló con la edad entre 0,63 (buena) al año de edad y 0,94 (muy buena) a los cuatro años de edad. La seroincidencia acumulada fue máxima para el grupo H durante los primeros seis meses en el rebaño adulto y fue disminuyendo hasta ser nula a los cuatro años de edad. De estos resultados se deduce la importancia fundamental de la transmisión horizontal por contacto con animales infectados y su estrecha relación con el manejo y las condiciones de estabulación del rebaño. Además, el trabajo demuestra por primera vez la presencia continuada de viremia en adultos detectable mediante PCR.

Como consecuencia de los resultados de la experiencia anterior se planteó la hipótesis que dio lugar al segundo trabajo de la tesis: “Si el contagio horizontal es clave en la infección por el VMV cabe esperar que el virus sea poco prevalente en rebaños en cría extensiva en pastoreo y potencialmente muy prevalente en rebaños en estabulación intensiva”. Para confirmar esta hipótesis se planteó un estudio de prevalencia e incidencia de Maedi Visna de tres años de duración en 38 rebaños de tres sistemas de explotación ovino característicos en España: el de ovino latxo lechero en régimen semi-intensivo del País Vasco, el de de ovino Assaf lechero intensivo de Castilla9León, y el de producción de cordero Manchego cruzado en régimen extensivo en Castilla la Mancha. La encuesta serológica realizada el primer año reveló una seroprevalencia de 5% en los rebaños extensivos, 25% en los rebaños semi-intensivos y 77% en los rebaños intensivos y la seroprevalencia se correlacionó positivamente con el tiempo de estabulación. Sin embargo, se observaron variaciones en la seroprevalencia entre rebaños de un mismo sistema productivo que no se relacionaron con las características estructurales de las instalaciones estudiadas y en concreto con el área de nave abierta, considerada indicativa del grado de ventilación de la nave.

La baja o nula seroprevalencia observada en algunos rebaños extensivos, asociada a la escasa transmisión horizontal, es compatible con resultados anteriores de nuestro grupo que indican que la transmisión lactógena es incapaz por si sola de mantener el VMV en la población. El hallazgo sugiere además que muy probablemente sería sencillo y barato eliminar el virus de rebaños en producción extensiva.

Durante los dos años siguientes del trabajo anterior se investigó la incidencia de seroconversion a VMV en los rebaños intensivos y semi-intensivos y los resultados de dicho análisis dieron lugar al tercer trabajo de esta tesis. La tasa de seroconversión fue 0,09 ovejas/año en el sistema semi-intensivo latxo y 0,44 ovejas/año en el sistema intensivo Assaf. Se observó variabilidad significativa en la incidencia de seroconversion entre rebaños del mismo sistema productivo y según la edad. De este modo la incidencia fue máxima en las corderas de rebaños intensivos durante el primer año de vida y aumentó de forma gradual según la edad en rebaños semi9extensivos. En el análisis multivariable de regresión logística la seroconversión se asoció positivamente al producto de la prevalencia del rebaño y los días de estabulación y fue mayor para las hijas de madres seropositivas que para las de madres seronegativas, independientemente del modo de cría durante la lactancia, con madre seropositiva o seronegativa. Estos resultados corroboran la estrecha relación entre la seroconversión y la presión de infección horizontal en el rebaño y aportan más evidencia que sugiere de la existencia de un componente heredable de resistencia/susceptibilidad a la infección por el VMV. Por el contrario, en el análisis multivariable de la incidencia de seroconversión tampoco demostró asociación entre ésta y las variables relacionadas con las características estructurales de las instalaciones, ni con el modo de cría de la reposición durante la lactancia. La ausencia de relación entre las instalaciones y la incidencia de infección podría asociarse al número relativamente escaso de rebaños estudiados y a la naturaleza compleja de la ventilación que depende de factores no determinados en este estudio y que sería importante investigar. Por otro lado, otros trabajos anteriores han demostrado que en rebaños con intensa transmisión horizontal, la transmisión lactógena no aumenta significativamente el riesgo de infección en la vida del animal.

Los resultados del trabajo descritos en el capítulo 1 sugirieron que el análisis de anticuerpos anti9VMV mediante ELISA es un buen método para estudiar la infección por VMV en ovejas adultas, aunque la PCR permitió detectar algunos animales infectados y seronegativos. La mayoría de los protocolos de PCR descritos en la literatura se basan en la detección de ADN de VMV integrado en los monocitos en vez de ARN de virus libre. Además muchos asumen que la sensibilidad de la técnica mejora si la prueba se realiza en ADN de monocitos previamente separados de los hematíes. Sin embargo, apenas existen trabajos en los que se haya comparado la validez diagnóstica de protocolos de PCR con métodos de aislamiento y purificación de ADN diferentes. En el cuarto trabajo de ésta tesis se compara la sensibilidad respecto al ELISA de protocolos de PCR distintos según las secuencias de VMV objetivo, el tipo de muestra sanguínea y el método de purificación de ADN empleado. Como material de partida se escogieron 25 animales ELISA-seronegativos y 25 ELISA-seropositivos de los que se tomaron muestras de suero, coágulo sanguíneo y células blancas. Se extrajo el ADN y ARN de las muestras mediante kit comerciales de columnas de sílice y el método clásico de extracción fenólica y se analizó la presencia de virus libre (ARN) y asociado a monocitos (DNA) con las técnicas de PCR basadas en las secuencias LTR y gag del virus. En una primera selección de 10 muestras de animales seropositivos se obtuvo una mayor proporción de resultados positivos con la PCR9gag que con la PCR9LTR y en ADN de coagulo sanguíneo extraído mediante kit comercial que en otras matrices. No se detectó ADN proviral en las muestras de suero pero se detectó RNA de virus libre en un animal seropositivo. Los resultados de los análisis realizados en las muestras de los 50 ovinos confirmaron los resultados preliminares indicando un porcentaje de gagC PCR-positivos de 68% en células blancas y 92% en coágulo sanguíneo (p<0.05). Esta técnica permitió detectar provirus en 25% de las muestras seronegativas y con ella se obtuvo la mejor correlación entre los resultados de ELISA y PCR. No existen estudios anteriores sobre el empleo de protocolos de PCR basados en ADN de coágulo sanguíneo y en esta tesis se plantean posibles razones para explicar la buena sensibilidad asociada a este protocolo. Se trata en cualquier caso de un hallazgo de clara utilidad práctica por que además de mejorar la sensibilidad de la prueba, evita la necesidad de purificar leucocitos para aislar el ADN molde y hace accesible al diagnóstico la muestra de sangre coagulada que es la de elección en las campañas de saneamiento de enfermedades ovino.

Documento completo:

http://buleria.unileon.es/xmlui/bitstream/handle/10612/1621/Epidemiologia_Leginagoikoa.pdf?sequence=1