Actualización de la presencia de resistencias a los fármacos antihelmínticos en el ganado ovino de León y Zamora

Los nematodos gastrointestinales (NGI) se encuentran entre los parásitos más extendidos y relevantes de las ovejas en todo el mundo y su elevada prevalencia deriva en importantes impactos económicos en la industria ganadera, con efectos sobre la producción animal y los costes de los tratamientos. En Europa, se estima que las pérdidas asociadas alcanzan los 1.800 millones de euros anuales, siendo las infecciones por NGI responsables de aproximadamente el 38% de este total (Charlier y cols., 2020). Estos parásitos colonizan el abomaso y el intestino delgado de estos animales, interfiriendo con procesos clave como la digestión y la absorción de nutrientes, lo que puede conducir a desarrollar signos clínicos de infección (Miller y cols., 2012), como podrían ser anemia, o hipoproteinemia, y otros signos más inespecíficos como apatía, disminución del rendimiento productivo, pérdida de peso, disminución del apetito y, en ocasiones, incluso la muerte.

En la actualidad, el uso de fármacos antihelmínticos sigue siendo una estrategia fundamental de control de las infecciones por NGI tanto en medicina veterinaria como en la salud humana. Entre ellos, la ivermectina, perteneciente al grupo de las lactonas macrocíclicas, se ha consolidado desde su introducción en la década de 1990 como un antiparasitario de referencia contra nematodos parásitos en los animales domésticos (Laing y cols., 2017), debido a su elevada eficacia, amplio espectro de acción y alto margen de seguridad. Por su parte, los benzimidazoles han sido utilizados de forma rutinaria en toda Europa desde su lanzamiento al mercado en la década de 1960, pero su uso prolongado ha favorecido la aparición de resistencias a esta familia, provocando graves problemas en las explotaciones de pequeños rumiantes de todo el mundo (Papadopoulos et al., 2012). Ante la creciente aparición de resistencia a los antihelmínticos, la correcta detección de la misma de forma fiable es algo crucial, ya que un diagnóstico preciso ayudaría a evitar que se generalizara. En este sentido, el objetivo del presente estudio fue evaluar el nivel de resistencia antihelmíntica presente en rebaños de ovejas del noroeste de España infectados por NGI aplicando técnicas in vitro como el EHT para detectar la resistencia a fármacos de la familia de los benzimidazoles, e in vivo como el FECRT, frente a las lactonas macrocíclicas.

Con este objetivo, el presente estudio se centró en evaluar el nivel de RA en rebaños ovinos del noroeste de España infectados por NGI, aplicando técnicas in vitro, como la prueba de eclosión de huevos (o EHT, del inglés, Egg Hatch Test) para los benzimidazoles, y pruebas in vivo, como el test de reducción del recuento de huevos en heces (o FECRT, del inglés Faecal Egg count Reduction Test), para las lactonas macrocíclicas.

Muestreo de explotaciones de ganado ovino

El estudio se desarrolló entre 2022 y 2024, centrándose en las estaciones de primavera y otoño, periodos en los que la infección por NGI alcanza su mayor prevalencia. El muestreo incluyó 47 explotaciones ovinas ubicadas en las provincias de León y Zamora, con sistemas de manejo extensivo o semiextensivo. Las explotaciones se seleccionaron al azar, en función de la voluntad de los ganaderos de participar. El criterio de inclusión en el estudio fue que los animales no hubieran sido tratados contra nematodos parásitos durante al menos ocho semanas antes del inicio del estudio y que hubiera al menos 25 ovejas adultas en pastoreo disponibles. Se evaluó la eficacia del albendazol en las 47 explotaciones y la eficacia de la ivermectina (IVM) en 30 de las 47 explotaciones.

Las muestras de heces se recogieron directamente del recto de cada animal de forma individual, y lo sobrante se mezcló en bote de plástico lleno de agua sin aire para evitar el desarrollo de los huevos. Las heces del bote se procesaron para concentrar los huevos con el fin de realizar un ensayo de eclosión de huevos (EHT) para cada lote.

Tras la recogida de muestras en la explotación, cada oveja seleccionada fue desparasitada por vía oral con ivermectina (Oramec ® 0,8 mg/ml solución oral para ovejas y cabras, Boehringer Ingelheim) a razón de 0,2 mg/kg de peso corporal.

Detección de resistencias antihelmínticas a las lactonas macrocíclicas mediante el ensayo in vivo ‘ensayo de reducción del conteo de huevos en heces’ o FECRT

Para evaluar la eficacia de la ivermectina se aplicó la prueba de reducción del recuento de huevos en heces (FECRT), considerada el método de referencia in vivo para la detección de resistencia antihelmíntica. En cada uno de los 30 rebaños seleccionados, se tomaron muestras fecales individuales de animales elegidos al azar y se realizaron análisis coprológicos para cuantificar la carga parasitaria, expresada como número de huevos por gramo de heces (hgh).

La coprología se realizó mediante la técnica de McMaster modificada y utilizando una solución saturada de cloruro sódico (densidad = 1,2 g/ml) para el recuento de huevos. La sensibilidad de esta técnica fue de 15 hgh. Tras ello, los animales se desparasitaron con la ivermectina por vía oral y posteriormente, entre los días 14-17 post-tratamiento (pt), se recogieron nuevamente heces de los mismos individuos para determinar la evolución de la excreción de huevos.

La eficacia del tratamiento se estimó a partir del porcentaje de reducción del recuento de huevos en heces entre ambos momentos de muestreo. Este parámetro se calculó comparando la media de hgh antes y después del tratamiento, lo que permite cuantificar de forma objetiva la respuesta parasitaria al fármaco y, en consecuencia, detectar posibles casos de resistencia. Si el porcentaje de reducción es mayor al 95% el rebaño se considera susceptible al fármaco, si se encuentra entre el 90-95% es que existe sospecha de resistencia, y si es menor del 90% el rebaño se considera resistente (Martínez Valladares y cols., 2020).

Detección de resistencias antihelmínticas a los benzimidazoles mediante el ensayo in vitro ‘ensayo de eclosión de huevos’ o EHT

El EHT se empleó como método in vitro para detectar resistencia a antihelmínticos del grupo de los benzimidazoles. Esta técnica se fundamenta en las propiedades ovicidas de estos fármacos y en la capacidad de los huevos procedentes de cepas resistentes para desarrollarse y eclosionar a concentraciones de fármaco superiores a las toleradas por cepas susceptibles.

El ensayo se llevó a cabo en las 47 explotaciones incluidas en el estudio utilizando muestras obtenidas antes de la administración del tratamiento antihelmíntico. A partir de un pool de heces de cada explotación, los huevos de NGI se aislaron mediante técnicas coprológicas de flotación. Posteriormente, se realizó el recuento de huevos y se prepararon cultivos en placas de 24 pocillos, que fueron incubadas durante 48 horas a 23 °C en presencia de tiabendazol a una concentración correspondiente a la dosis eficaz 50 (DE50 = 0,1 μg/ml), siguiendo la metodología descrita por Coles y cols. (1992). Tras ese tiempo, se contó el número de larvas de primer estadío o larvas 1 (resultantes de los huevos desarrollados) y huevos muertos (huevos sin desarrollar, habiendo sido el fármaco eficaz) presentes por pocillo utilizando un microscopio invertido, y se calculó el porcentaje de eclosión utilizando la siguiente fórmula: % eclosión = número de larvas 1/ (número de larvas 1 y huevos muertos).

La eficacia del fármaco se estimó comparando los porcentajes de eclosión de los pocillos control y de los pocillos tratados con el antihelmíntico, utilizando la siguiente fórmula: % eficacia del fármaco = [(media % eclosión pocillos control – media % de eclosión pocillos con fármaco) / (media % eclosión pocillos control)] x 100.

De acuerdo con los criterios establecidos, las explotaciones se clasificaron como resistentes cuando la eficacia del fármaco fue ≤ 50%, como sospechosas de resistencia cuando la eficacia se situó entre el 51% y el 60%, y como susceptibles cuando la eficacia fue > 60%.

La prevalencia de las infecciones por NGI a nivel de rebaño fue del 100% ya que todas las explotaciones muestreadas se encontraban parasitadas en el momento de la realización del estudio. La media de eliminación fecal en los 47 rebaños infectados por NGI fue de 245 hgh, con un rango que varió entre 15 y 6135 hgh. Las ovejas pertenecían a distintas razas, principalmente Merina (28%), Assaf (14%), Churra (12%), Castellana (10%), razas mixtas (6%) y Awassi (2,2%), destinadas tanto a la producción de leche como de carne. La mayoría de los estudios sobre resistencias hasta ahora realizados en España se han llevado a cabo en las Comunidades Autónomas de Galicia, Castilla y León y Aragón. En el presente estudio, desarrollado en las provincias de León y Zamora, los resultados obtenidos mediante el EHT mostraron resistencia a los benzimidazoles en el 10.6% de los rebaños muestreados, mientras que en el 4,2% hubo sospecha de resistencia. Por lo tanto, teniendo en cuenta sospechosos y resistentes se considera que en el 14,8% de los rebaños el albendazol no resultó eficaz. Según el FECRT del estudio para ivermectina, el 43,3% de los rebaños muestreados se consideró resistente y el 13,3% con sospecha de resistencia, siendo el total de resistentes y sospechosos del 56,6%.

La comparación de estos resultados con estudios previos realizados en Castilla y León pone de manifiesto una evolución creciente de la resistencia antihelmíntica en la región. Entre 1999 y 2011, los niveles de resistencia frente a los benzimidazoles y a las lactonas macrocíclicas se mantuvieron relativamente estables, con prevalencias aproximadas en torno al 13 y 27%, respectivamente. Sin embargo, estudios posteriores realizados entre 2015 y 2016 mostraron un incremento de la resistencia a los benzimidazoles hasta el 26% mediante EHT (Martínez Valladares y cols., 2020). Asimismo, al comparar los niveles de resistencia de la zona de estudio con años anteriores mediante FECRT, se observa un incremento significativo de la resistencia a las lactonas macrocíclicas en los últimos años, que parece que sigue aumentando, por lo que mediante este estudio se evidencia una vez más la necesidad de plantear estrategias integradas para combatir las resistencias, como el uso de combinaciones de fármacos, las mejoras en la gestión de los pastos, el estudio para el desarrollo de vacunas, la selección genética o la fitoterapia.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por la ‘Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación’ (MCIN/AEI/PID2020-119035RB-I00 y PID2024-161894OB-C21). La red temática SPARC está financiada por la Unión Europea (Horizonte Europa, número de proyecto 101134842). Este estudio se basa en trabajos desarrollados en el marco de la Acción COST (CA23154, Environmental impact of anthelmintics in livestock and alternatives to minimize their use) (European Cooperation in Science and Technology)

LGdP es beneficiario de un contrato de la Junta de Castilla y León (JCyL) (LE096-20), apoyo financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por el “FSE invierte en tu futuro”. Agradecemos al Fondo Social Europeo Plus, al Programa Operativo de Castilla y León y a la Junta de Castilla y León, a través de la Consejería de Educación. EVG fue contratada en el marco de la iniciativa Generación D, promovida por Red.es, entidad adscrita al Ministerio para la Transformación Digital y de la Función Pública, para la atracción y retención de talento mediante ayudas y contratos de formación, financiados por el Plan de Recuperación, Transformación y Resiliencia a través de los fondos Next Generation de la Unión Europea.

Referencias bibliográficas

• Charlier, J., Rinaldi, L., Musella, V., Ploeger, H., Chartier, C., Vineer, H. R., Hinney, B., Von Samson-Himmelstjerna, G., Bacescu, B., Mickiewicz, M., Mateus, T., Martinez-Valladares, M., Quealy, S., Azaizeh, H., Sekovska, B., Akkari, H., Petkevicius, S., Hektoen, L., Höglund, J., ... Claerebout, E. (2020b). Initial assessment of the economic burden of major parasitic helminth infections to the ruminant livestock industry in Europe. Preventive Veterinary Medicine, 182, 105103.
• Coles, G., Bauer, C., Borgsteede, F., Geerts, S., Klei, T., Taylor, M., & Waller, P. (1992). World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W.A.A.V.P.) methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance. Veterinary Parasitology, 44(1-2), 35-44.
• Laing, R., Gillan, V., & Devaney, E. (2017). Ivermectin–old drug, new tricks?. Trends in parasitology, 33(6), 463-472.
• Martínez-Valladares, M., Valderas-García, E., Gandasegui, J., Skuce, P., Morrison, A., De Agüero, V. C. G., Cambra-Pellejà, M., Balaña-Fouce, R., & Rojo-Vázquez, F. A. (2020). Teladorsagia circumcincta beta tubulin: the presence of the E198L polymorphism on its own is associated with benzimidazole resistance. Parasites & Vectors, 13(1).
• Miller, J.E.; Kaplan, R.M.; Pugh, D.G. Internal Parasites. In Sheep and Goat Medicine; Elsevier: Amsterdam, The Netherlands, 2012, 106–125. ISBN 978-1-4377-2353-3.
• Papadopoulos, E., Gallidis, E., & Ptochos, S. (2012). Anthelmintic resistance in sheep in Europe: A selected review. Veterinary Parasitology, 189(1), 85-88.