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INFLUENCIA DE LA MICROBIOTA VAGINAL Y ESPERMÁTICA EN LA FERTILIDAD

SEGUNDA SESIÓN / Seminario ‘Avances en la reproducción del ovino: los retos pendientes’. Patrocina ZOETIS.

MALENA SERRANO NOREÑA. Científico titular de OPIs en el Instituto Nacional de Investigaciones Agroalimentarias (INIA)

 

 

La microbiota forma parte de los seres multicelulares (animales, plantas). Su importancia es alta. De hecho, en los animales superiores se denomina ‘el segundo genoma’. Se ha comprobado que hay una coevolución de los genomas. Por ejemplo, en el ser humano la microbiota del aparato digestivo supone unos tres millones de genes frente a los 23.000 genes del ser humano. Además, existe una interacción entre los genes del hospedador y de la microbiota. No se les debe considerar patógenos, porque hay microbios que sí lo son, pero también hay microbiota que es necesaria para vivir.

 

DEFINICIONES

La microbiota es definida como el conjunto de microorganismos en un ambiente concreto en individuos sanos. Forma parte del funcionamiento normal del organismo. Además, esa microbiota tiene una relación simbiótica comensal con el hospedador, de forma que se obtienen beneficios mutuos. En otros órganos del cuerpo, previenen de infecciones de otros microorganismos.

El microbioma es un paso más que la microbiota. Es el hábitat que ocupa esa microbiota y todos los factores bióticos y abióticos que rodean ese hábitat.

El metagenoma es el conjunto de genomas de esos integrantes del microbioma. Por lo tanto, la metagenómica es la parte de la genética que se dedica al estudio de los genomas de estos microorganismos. Ahora está de moda porque se ha demostrado que es muy importante en muchas enfermedades en el ser humano y en el funcionamiento normal del organismo. También se ha demostrado la importancia en animales, como la digestión ruminal, sobre todo en vacuno.

El término holobionte se refiere al conjunto del genoma del hospedador y el genoma de la microbiota y que funcionan de una forma conjunta. Hay genes del hospedador que benefician a la microbiota y genes de la microbiota que interaccionan con el hospedador.

Por último, la disbiosis es el desbalance de esa microbiota, más por aspectos de patología, es por cambios en su composición que hacen que el hospedador sea menos eficiente en su alimentación o reproducción.

Las líneas de investigación de la genética se centran en saber si existe un determinismo genético en el hospedador que propicie una microbiota concreta que sea beneficiosa en la eficiencia de alimentación y reproducción. Se busca a través de la caracterización de los genomas de la microbiota, intentando asociar las diferencias en genoma de la microbiota con las del hospedador. Existe un ejemplo en emisiones de metano y eficiencia ruminal en bovino, pero todavía hace falta mucha investigación en este ámbito.

 

PROYECTO EN INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

Se trata de un proyecto en el que participaron varias entidades (INIA, Life Sequencing, Ovigén y CITA) y que fue presentado en el Congreso Mundial de Genética de Nueva Zelanda. Fue una primera incursión en intentar caracterizar la microbiota vaginal y espermática en ovinos. Además, queríamos asociar la abundancia en variabilidad y géneros de esa microbiota con el resultado de la inseminación.

La inseminación artificial es una herramienta fundamental en los programas de selección genética animal, y fundamentalmente en las razas de leche. La inseminación artificial es necesaria para testar animales, y para conectar ganaderías y que los valores genéticos estimables sean comparables entre toda la población. Además, es el mejor sistema para difundir la mejora genética con machos élite que ayudan a la difusión. El problema de la inseminación artificial en ovino es que tiene una eficiencia relativamente baja por causas como el sistema reproductivo especial de la oveja, que hace difícil el acceso del semen al útero, el hecho de requerir necesariamente semen fresco y el hecho de desconocer el momento exacto del ciclo ovulatorio de la oveja en el momento de la inseminación. También influyen otros aspectos como el manejo del rebaño, el estado corporal de la oveja, aspectos nutricionales y genéticos…

Es un carácter complejo, regido a nivel genético por muchos genes y, a diferencia de otros caracteres, es fruto de la genética del macho y de la hembra. Por lo tanto, la evaluación genética es muy compleja y la modelización estadística está muy atrasada. Es difícil combinar la información de varios genomas. Además, las pocas incursiones que se han hecho en valoraciones genéticas de fertilidad presentan heredabilidades muy bajas, con lo que tiene un componente ambiental muy importante y en un esquema de mejora tendría una respuesta muy lenta. Aún así, se puede afrontar de otras maneras. Aprovechando los genotipados que se han hecho para selección genómica, se han hecho experimentos para intentar buscar en el genoma regiones que sean responsables de algún porcentaje de fertilidad. Hay opciones de conseguir pequeños porcentajes de fertilidad con reproducción asistida por genes o quizás, en el futuro, la selección genómica.

Con todos estos problemas que tiene la fertilidad, nos planteamos si la microbiota que se encuentra en el tracto reproductivo de machos y hembras tiene alguna responsabilidad en la fertilidad. Se abordó desde una perspectiva de secuenciación masiva, ya que únicamente un 1% de microorganismos son cultivables, por lo que no se detectarían por esa técnica. Por PCR hay posibilidades, pero siempre que se conozca lo que se quiere amplificar, ya que la PCR se tiene que diseñar para un microorganismo en concreto. Por lo tanto, ante estas limitaciones, las técnicas de secuenciación permiten secuenciar absolutamente todo.

Esta experiencia se desarrolló prácticamente sin ningún conocimiento previo. Únicamente había un trabajo de hace dos años de Schwarz, en el que hay un primer intento de describir la microbiota vaginal de ovejas y compararla con vacas y cabras. Es un trabajo muy somero, con unos datos modestos. Sí que hay experiencias en humanos, pero realmente son cuestiones muy diferentes. El ser humano es la única especie de mamíferos en el que el microambiente vaginal de las mujeres es totalmente distinto, ya que tiene un pH de 4, y sin embargo en el resto de los mamíferos están entre 6,5 y 7 de pH. La microbiota de la mujer son fundamentalmente ‘Lactobacillum’, que son capaces de crecer en un pH tan ácido, por lo que protegen de otras infecciones de otros microorganismos. Sin embargo, esta situación no es así en el resto de los mamíferos, por lo que la bibliografía es poco aprovechable. También es cierto que el ser humano domesticó a las ovejas, imponiendo un ciclo reproductivo totalmente distinto al que tenían entonces. Entonces, ese pH vaginal y microbiota vaginal era suficiente para un ciclo reproductivo en la naturaleza, en la que no existe la presión de reproducción que tienen ahora. En humanos, al ser un ritmo reproductivo mucho más bajo, ese pH tan bajo es evolutivamente necesario para ese ritmo.

Se diseñó un experimento con unos rebaños de ovejas. Se trabajó con cinco rebaños y cinco machos de inseminación artificial. Se intentó reducir el efecto del ambiente, ya que la fertilidad por la inseminación artificial tiene mucho ruido ambiental, por lo que se optó por el mismo número de animales (10) en cada rebaño y se utilizaron esponjas de sincronización con antibiótico con cinco ovejas de cada rebaño y sin antibiótico con las otras cinco. Además, cada macho inseminó a dos ovejas de cada rebaño, una con esponja con antibiótico y otra sin antibiótico. El objetivo era estudiar la microbiota vaginal y espermal, y comprobar el efecto del antibiótico.

Justo antes de la inseminación artificial, se cogieron con hisopos muestras vaginales, mientras que en el macho se tomaron de las pajuelas de la inseminación. De esos hisopos se puede separar el ADN que procede de células del animal y de células de los microorganismos, porque las paredes celulares de los microorganismos son mucho más duras, con lo que se puede analizar primero las células de las ovejas y, una vez eliminado la parte de ADN de las células del hospedador, romper las células de los microorganismos y acceder a ese ADN. Puede ocurrir que se arrastre ADN del hospedador, pero se puede eliminar con técnicas de mapeo. Posteriormente, se realiza una secuenciación de unas regiones concretas del gen 16s del rRNA. El ADN se rompe y en las técnicas de secuenciación se consiguen fragmentos de unas 300 ‘letras’, que son como piezas de un puzzle. Con procesamiento informático, se eliminan las piezas que no están en condiciones. Una vez que están depuradas, se lanzan en una base de datos de microorganismos, que es como la plantilla del puzzle. En esta base de datos se contienen todas las secuencias de genoma del 16s del rRNA de millones de microorganismos. Se puede cuantificar ya que, cuantas más piezas iguales correspondan a la parte de la plantilla, hay más microorganismos de ese tipo en concreto.

Una vez que se identificaron todos los microorganismos presentes, con vistas a caracterizar la microbiota y comprobar si tenía algún efecto sobre la fertilidad, se hicieron comparaciones de las familias, géneros y especies sobre los siguientes aspectos: tratamiento de la esponja con antibiótico o sin él, temperatura rectal, diferencias de los rebaños, diferencias en los machos de inseminación y en el resultado de la inseminación.

 

RESULTADOS

Los resultados nos permitieron definir la microbiota que se encuentra en una pajuela de semen de un carnero y el tracto vaginal de las ovejas.

En el resultado de la inseminación artificial, hubo diferencias moderadas de éxito en los machos, bajo éxito en las hembras y bastantes diferencias en los distintos rebaños. Los géneros más representativos fueron ‘Corynebacterium’ y, en el caso de ‘Pseudomonas’, sobre todo en machos. Hay tres que sólo aparecieron en las ovejas, y además no en todos los rebaños, que son ‘Actinobacillus’, ‘Sneathia’ y ‘Streptobacillus’.

Se intentó comprobar si esa abundancia de microorganismos afectaba al uso o no de antibiótico en las esponjas. Se vio que únicamente había un género, que era ‘Streptobacillus’, que sí aparecía 21 veces más abundante en ovejas que tenían esponjas sin antibiótico, por lo que este antibiótico en concreto es eficiente contra este microorganismo. Para este género se encontró una especie, aunque en el caso de las especies hay que ser prudentes por las limitaciones del método de secuenciación, que fue ‘Streptobacillus notomytis’, que se encontró 19 veces más abundante en ovejas no preñadas. Así, su abundancia en el tracto vaginal parece afectar indirectamente a la tasa de preñez de las ovejas.

Hallamos otros tres géneros que afectan a la preñez, que son fundamentalmente ‘Sneathia’, que está en la especie humana relacionada con abortos; ‘Histophilus’; y ‘Actinobacillus’, que pertenece al género ‘Pasteurella’ y es responsable de enfermedades como la epidedimitis, de la infertilidad en machos y de abortos en hembras.

Entre rebaños también hubo diferencias. Los que tuvieron menos fertilidad tenían también abundancia de esos microorganismos como ‘Actinobacillus’ y ‘Sneathia’. Estos microorganismos no aparecieron en los machos de inseminación, por lo que se secuenciaron los machos de los rebaños con más problemas y sí aparecían.

 

CONCLUSIONES

- Es recomendable no usar el antibiótico, porque sólo funciona contra un género en concreto y puede generar problemas. La idea es utilizar un prebiótico o un probiótico para intentar mejorar el ambiente vaginal para que haya más éxito en la inseminación.

- Los géneros ‘Histophilus’, ‘Actinobacillus’ y ‘Sneathia’ juegan un papel importante en la infertilidad de la especie ovina y deben ser controlados.

- La microbiota es un aspecto que se debe seguir estudiando para analizar el éxito de fertilidad en la inseminación artificial.

Dentro de algunos años, será posible tener en casa un secuenciador, conectarlo al ordenador y tener el resultado de la metagenómica de la microbiota en apenas diez horas.

 

 

 

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